Retention of a recombinant GFP protein expressed by the yellow fever 17D virus in the E/NS1 intergenic region in the endoplasmic reticulum

The flaviviral envelope proteins, E protein and precursor membrane protein, are mainly associated with the endoplasmic reticulum (ER) through two transmembrane (TM) domains that are exposed to the luminal face of this compartment. Their retention is associated with the viral assembly process. ER-retrieval motifs were mapped at the carboxy terminus of these envelope proteins. A recombinant yellow fever (YF) 17D virus expressing the reporter green fluorescent protein (GFP) with the stem-anchor (SA) region of E protein fused to its carboxy terminus was subjected to distinct genetic mutations in the SA sequence to investigate their effect on ER retention. Initially, we introduced progressive deletions of the stem elements (H1, CS and H2). In a second set of mutants, the effect of a length increase for the first TM anchor region was evaluated either by replacing it with the longer TM of human LAMP-1 or by the insertion of the VALLLVA sequence into its carboxy terminus. We did not detect any effect on the GFP localisation in the cell, which remained associated with the ER. Further studies should be undertaken to elucidate the causes of the ER retention of recombinant proteins expressed at the intergenic E/NS1 region of the YF 17D virus polyprotein.

Aplicação de PCR em tempo real para avaliar viremia em humanos e primatas não humanos, imunizados com a vacina de febre amarela cepa 17DD e o vírus recombinante 17D-DENV / Application of PCR in real time to evaluate viremia in human beings and not human primates, immunized with the vaccine of yellow fever cepa 17DD and recombinant virus 17D-DENV

Um dos parâmetros principais para o estudo de atenuação de flavivírus é a determinação de sua capacidade de replicação. Neste contexto, empregamos o método de RT-PCR em tempo real que permite a detecção de ácidos nucléicos diretamente de amostras biológicas. Neste trabalho, utilizamos, então, esta tecnologia, para determinar a replicação de vírus de febre amarela 17DD e 17D-recombinantes, que expressam a proteína do envelope dos vírus dengue para validação destes como candidatos a vacinas. Esta metodologia foi empregada de forma complementar ao teste clássico de titulação viral por plaqueamento em culturas de células de vertebrados. Os materiais clínicos incluem soros de macacos rhesus previamente inoculados com estes vírus por via intracerebral ou subcutânea e soros de 32 indivíduos vacinados com vírus 17DD. O método demonstrou boa reprodutibilidade para amostras com título viral de até 2 Log10 PFU/mL com limite de detecção de até 10 PFU/mL ou 143 cópias /mL, sendo esta sensibilidade comparável ao que foi descrito para outros vírus analisados pela mesma tecnologia. Nesta faixa de concentração, os resultados obtidos pela metodologia de RT-PCR em tempo real mostraram-se compatíveis com os obtidos pelas técnicas de RT-PCR “semi nested” e pelo plaqueamento em soros de macacos inoculados com vírus 17DD. A análise comparativa da quantificação viral em espécimes clínicos de macacos sugere a limitada capacidade de replicação do vírus 17DD independente da via de inoculação. Os vírus 17D-recombinantes, avaliados neste estudo, demonstraram sua atenuação em relação ao vírus 17DD, tanto pela metodologia de RT-PCR em tempo real como por plaqueamento. Assim sendo, consideramos que a tecnologia empregada para o estudo da capacidade replicativa dos vírus 17DD e 17D-recombinantes em diferentes hospedeiros, demonstrou o perfil de atenuação dos vírus testados. Com relação aos vírus recombinantes 17D-dengue, estes resultados embasam a continuação do seu desenvolvimento como cand...